돼지 바이러스성 설사병 정밀 진단

돼지 설사병은 폐사율이 아주 높을 뿐만 아니라 일단 감염되었다가 회복된 자돈의 성장률 이 떨어지고 여타 질병에 대한 감수성이 높아지는 등 양돈 산업에 있어 생산성 저해에 가장 중요한 요인의 하나로 작용하고 있으며, 연중 다양한 형태의 설사병이 발생하여 막대한 피해를 주고 있다. 돼지의 주요 바이러스성 설사병은 전염성 위장염(Transmissible gastroenteritis : TGE)와 돼지 유행성 설사증(Porcine epidemic diarrhea : PED)과 돼지 로타바이러스 감염증이 알려져 있다. 돼지 전염성 위장염은 전파력이 매우 높아 폭발적으로 발생하며 2주령 이하의 자돈이 감염되면 심한 구토와 설사를 하게 되며, 거의 100% 폐사한다. 5주령 이상의 돼지나 어미 돼지는 일령이나 면역의 정도에 따라증상이 다양하게 나타나며 폐사하는 경우는 드물다. 우리나라에서는 주로 11월부터 다음해 4월 까지 겨울철에 주로 발생하나 최근에 들어서는 연중 지속적으로 발생한다. 원인체는 코로나 바이러스이며 소장의 융모 상피에서 증식한다. 잠복기는 18-24시간으로 매우 짧으며 전파속도는 2∼3일이면 전 돈군에 퍼질 정도로 빠르다. 특징적 증상은 갑작스런 구토에 이어 심한 수양성 설사를 하고 체중의 감소가 두드러 지며, 특히 2주령 이내의 포유자돈에서 심한 탈수에 이어 높은 폐사율을 나타낸다. 설사변은 수분이 많고 악취를 풍기며 처음에는 회백색이다가 점차 황색 또는 녹색을 띄고 2∼7일간 지속 된다. 10일령 이내의 포유자돈은 거의 모두 발병후 2-7일만에 폐사하고, 3주령 이상의 포유돈은 대개 살아남지만 발육이 늦고 위축돈이 된다. 이와 같은 돼지는 오랫동안 분변중에 바이러스를 배설하고, 비육돈이나 모돈은 식욕부진과 설사증상을 보이지만 수일내에 회복된다. 그러나 모돈의 경우 분만직후 이들 설사병에 감염될 경우 무유증으로 인하여 자돈에게 충분한 초유를 공급하지 못하기 때문에 모체 이행항체를 이용한 설사병 방제가 어렵다. 또한 호흡기등 주요질병에 대한 항체도 고르게 전달 되지 못하기 때문에 세균성 호흡기병에 대한 감수성이 높아지고 각종 악성 질병에 대한 백신 접종 적기에도 문제가 된다. 돼지 유행성 설사증은 일령에 관계없이 발생하며 구토와 수양성 설사가 특징적이며, TGE와 매우 유사한 증상을 일으키나 2주령 미만의 포유 자돈에서는 폐사율이 TGE보다 낮고 비육돈 및 성돈에서의 발병율은 보다 흔하게 나타난다. 코로나 바이러스에 속하는 유행성 설사 바이러스의 감염에 의하여 자돈에서 심한 복통과 식욕 감퇴, 침울을 나타내며 수양성 설사와 폐사를 주증으로 하는 급성 전염성 질병이다. 돼지 전염성 위장염과 유사한 질병으로 임상적 으로는 감별이 되지 않는다. 증상은 어릴수록 심하고 신생자돈 에서는 설사 직후에 식욕부진, 구토를 보이며 갑자기 수양성 설사를 일으킨다. 생후 1주령 이내의 신생 자돈에서는 탈수가 심하고, 3∼4일정도 설사를 하다가 폐사된다. 폐사율은 일령에 따라 다르며 생후 1주령 이내의 자돈 폐사율은 50%이고 심할 경우는 90%까지 폐사 되기도 한다. 이유후의 돼지는 수양성 설사가 4-6일 정도 지속된후 변이 점조성으로 되고 회복한다. 이유돈의 대부분은 회복하지만 체중 감소가 심하다. 비육돈군에서 PED가 발생했을 경우는 같은 돈사내의 모든 비육돈이 설사증상을 보인후 1주 정도 지나면 회복 되며 폐사율은 1-3%정도로 낮다. 비육 말기의 감염돈에서 설사 초기에 급성 경과로 갑자기 폐사한 돼지의 공통된 부검 소견으로 배 근육부에 괴사가 관찰된다. 돼지 로타바이러스의 감염증은 주로 2∼6주령의 자돈에서 설사를 일으키는데 3주령부터 이유돈에서 많이 발생한다. 대장균과 혼합 감염이 흔하며 이때 설사가 심하게 나타난다. 병의 원인체는 로타바이러스로 크기가 60∼70㎚의 구형의 바이러스로 차륜을 연상케 하는 2층의 capsid를 갖고 있으며 자연계에 매우 광범위한 숙주계를 갖고 있다. 국내 대부분의 양돈장에는 상재화 되어 있다. 1∼5주령 특히 이유자돈에서 많이 발생하며 TGE보다 설사 정도와 폐사율이 낮다. 감염 돼지의 분변 중에 다량의 바이러스가 배설되며 주로 경구 감염된다. 침울, 식욕 결핍, 설사, 탈수등이 주증상이며 움직이기를 꺼려한다. 단독 감염시에는 증상이 경미하고 폐사율도 10% 이내로 낮지만 세균, 바이러스, 기생충등과 복합감염시에는 증상도 심하고 폐사율도 높게 나타난다. 이들의 진단을 위한 방법은 다음과 같다.

현재 돼지 코로나바이러스에 의한 두 질병을 감별하기 위하여 바이러스분리동정, 형광항체 검사법, 면역조직화학 염색법, ELISA 기법, 전자현미경 기법, PCR 방법등이 사용된다.

1. 전자 현미경법

바이러스의 구조를 직접 관찰할 수 있는 방법으로 전자현미경은 특히 자돈의 설사병중 바이러스 분리가 용이하지 않은 여러 바이러스의 진단에 크게 활용 될 수 있다. 전자 현미경으로 보면 TGE 및 PED virus 입자는 coronaviridae에 속하는 다른 바이러스들과 유사한 특징을 갖는다. 분변재료 에서 확인 되는 입자들은 구형에 가까운 다형체이다. 입자 표면에 돌출한 spike 구조까지 포함한 평균 직경은 130㎚로 95∼190㎚의 범위를 나타낸다. 곤봉상의 spike 구조는 18∼23㎚이며, 중앙 으로부터 방사상으로 위치하고 있으며 이들 구조가 태양의 무리나 왕관의 모양과 비슷하다 하여 coronavirus 라고하는 이름이 붙여 졌다.

2. 면역 전자 현미경 기법

전자 현미경을 이용하여 각종 전염병의 원인체인 미생물을 검사하는 일반적인 전자현미경 기술에 실험자가 원하는 미생물에 대한 특이 다가 항체나 단크론 항체를 반응 시켜 원하는 미생물의 검출 효율을 높이는 방법이다. 원하는 시료에다 항체를 반응시켜 항원 항체의 복합체를 만들어 원하는 설사병 병원체의 시야당 관찰갯수를 증가시킴과 동시에 항체에 반응하는 항원을 손쉽게 찾아내는 방법이 일반적이며, 이보다 발전된 방법으로는 항체에 직접 일정한 크기의 표식 물질을 부착하거나 이차 항체에 표식물질을 부착하여 특이적으로 결합한 항원 항체의 복합체 뿐만 아니라 이의 표식 물질이 더욱더 검출 효율을 증가 시켜주는 방법이 있다. 주로 immuno-gold 법이 많이 이용되고 있으며 페리틴이나 다른 표식 물질도 사용이 가능하다.

3. 형광항체법

1958년 Riggs가 FITC(Fluorescein Isothiocyarnate)를 합성하고 1961년 미국의 Coons가 형광항체의 가능성을 보고했다. 항원항체 반응이 가지고 있는 높은 특이성을 이용하고 형광 물질이 짧은 파장의 형광에 밝게 빛나는 성질을 이용하여 원하는 병원체나 단백질을 관찰하고 동정하는 것으로 미생물학 분야에서 항원, 항체의 감별, 진단, 검출, 동정하는 혈청반응으로 널리 이용하고 있다. 가축전염병의 진단을 신속히 할수 있으며 특이성이 높아 감염초기에도 진단이 가능하다. TGE, PED 와 Rotavirus 는 monoclonal antibody를 이용한 형광 항체법에 의해 감별진단할수 있다. 검사재료는 소장 특히 회장 부위가 적합하며, 감염초기의 돼지에서 가검물을 채취하는 것이 중요 하다. 감염후 상당기간이 경과되면 소장의 융모세포가 탈락하여 형광항체법으로 진단이 곤란 하다. 검사방법은 회장 조직을 동결절편하여 아세톤으로 고정한 뒤 TGE, PED 또는 Rotavirus monoclonal antibody를 첨가한후 FITC conjugated anti mouse IgG를 반응시켜 결과를 판독한다.

4. PCR

80년대이후 자연과학분야의 기장 큰 발전중의 하나로 중합효소 연쇄반응(PCR)기법의 발견을 들수 있다. PCR은 생물체의 genomic DNA(RNA)로부터 원하는 특정 DNA(RNA) 단편을 시험관내 에서 선택적으로 복제, 증폭하는 방법으로 가축 전염병 질환의 원인체 진단에도 사용가능하다. PCR은 열에 의해 double stranded DNA 또는 cDNA의 단일 가닥으로 분리(denaturation), 특이적 primer의 결합(annealing), DNA polymerase에 의한 새로운 DNA가닥의 합성(extension)등의 3가지 단계의 연속적인 반복에 의해 이루어진다. 이러한 PCR이 시험관내에서 가능하게 된 것은 열에 견디는 DNA polymerase의 발견 때문이다. DNA polymerase는 각종 세균중에서 열에 강한 내성을 가진 세균들에서 분리된 효소로 가장 널리 사용되고 있는 Tag I polymerase를 비롯하여 여러 가지가 시판되고 있으므로 실험의 특성에 따라 선택적으로 사용할수 있다. DNA polymerase는 single stranded template를 이용하여 상보적인 DNA 염기서열을 5'에서 3'방향으로 합성한다. 이러한 반응을 primer extension이라한다. PCR의 결과는 DNA polymerase의 종류, primer의 농도, MgCl2와 같은 금속이온이나 dNTPs의 농도, PCR buffer의 조성 등에 의해 영향을 받는다. PCR은 신속성과 정확성 그리고 단백질보다 상대적으로 변성이 느린 유전자를 대상으로 함으로 진단의 효율을 높일수 있는 잇점이 있다. 그러나 민감도가 너무 높기 때문에 오염에 의한 비특이가 있을 수 있으므로 이에 대한 대비가 실험전에 되어야 한다. TGE나 PED는 특이 primer를 사용한 PCR을 이용하여 감별진단이 가능한데, 설사 분변이나 설사돈의 소장을 이용하여 진단이 가능하다. 로타바이러스의 감염증도 진단할수 있다. 검사재료는 설사돈의 소장이나 설사 분변을 채취하여 실험한다.

5. RNA electropherotyping

Rotavirus를 분리동정할 때 사용하는 방법으로 설사분변을 이용하여 분변내의 rota virus를 polyacrylamide gel을 사용하여 검출해 낼수 있다. 분변내에 존재하는 rotavirus 의 RNA를 phenol/ chloroform으로 추출하고 이를 전기 영동법으로 분획한 다음 silver staining으로 rotavirus RNA를 염색하여 rotavirus 의 group을 동시에 진단하는 방법으로 신속하고 아주 민감한 시험법이다.

6. ELISA

여러 시료를 동시에 진단하는 방법으로 ELISA 법이 아주 유용하게 이용될 수 있다. ELISA 에도 여러 가지 서로다른 방법이 있으나 원리는 대동소이 하며 특히 혈청학적인 진단에 적합한 방법 이다. 항원이 코팅된 plate에 가검혈청을 가하고 혈청에 대한 2차항체에 부착된 효소를 substrate를 이용하여 발색 시키는 방법이다. 소화기 바이러스에 대한 특이항체를 진단할 수 있다. 로타 바이러스의 경우 사람의 로타바이러스 진단 킷드를 이용하여 간편하게 분변내의 로타바이러스 존재 유무를 검사할 수 있는데 이 방법 또한 변형된 ELISA 방법이다.

7. 간접형광항체법(IFA)

혈청중에 존재하는 TGE, PED, Rota virus에 대한 항체가를 조사하기 위해서는 이 방법을 사용한다. 각각의 바이러스가 접종된 서로다른 96 well plate에 단계별로 희석된 가검혈청을 가하고 FITC가 부착된 2차 항체로 혈청중에 존재하는 특이 항체를 측정하는 방법이다. 이는 중화 항체시험, ELISA 방법 등과 함께 소화기 바이러스를 진단하는 방법으로 널리 이용되고 있으며 특히 rotavirus의 혈중 항체 진단을 위하여 유용하게 사용될 수 있는 시험법이다.