클래미디아의 임상적 특징 및 진단

클래미디아는, 스위스의 Ritter에 의하여 1879년에 최초로 인체 감염예가 보고된 바 있으며, 그 후 산발적으로 증례가 보고되어 주목을 받고 있다. 특히, 1929 - 30년에는 세계각지에서 남미로부터 수입된 조류를 감염원으로하는 유행이 발생되어, 중요한 인수공통전염병의 하나로 관심을 집중 시킨 바 있다.

본 편에서는 클래미디아의 임상적 특징을 알아보고, 클래미디아감염증의 국제표준과 관련하여 양의 유행성 유산증과 조류의 앵무병 진단기법에 관하여 고찰한 다음, 양의 유행성 유산증 방제를 위한 예방백신의 표준에 관하여 설명하고자 한다.

1. 클래미디아의 임상적 특징

클래미디아 감염에 따른 임상적 특징은 각 숙주별로 다양한 질병을 나타낸다는 점이다. 주요 클래미디아 감염증을 예를들면 다음과 같다. Chlamydia psittaci는 조류에서는 우선 앵무병을 나타내며, 주요숙주는 잉꼬와 칠면조이며 사람도 포함된다.

포유동물류에서는 고양이, 소, 양, 낙타, 돼지 및 말에서 폐렴과 다발성 관절염을 나타낸다. 특히 사람에 있어서는 고양이 할큄병 (Cat-scratch fever)도 보고되어 있다. 소와 말에는 장염이 보고되어 있고, 오포섬에서는 뇌염, 소에서는 뇌척수막염도 보고되어 있다. 한편, C. trachomatis는 사람에서 트라코마와 봉입체 결막염, 서혜림프육아종증을 일으키며, 마우스에 감염되면 폐렴을 일으킨다.

가. 원 인

분류학상, 세균과 바이러스의 중간위치에 있는, 리케치아에 가까운 클래미디아속에 속하는 클래미디아 시타시 (Chlamydia psittaci)와 클래미디아 트라코마티스 (C. trachomatis)가 본 병의 병인체로 알려져 있다. 각 동물병로 다양한 임상증상을 나타낸다.

특히 사람에서의 고양이 할큄병 (猫 ひっかき病; cat-scratch fever)은 발열과 림프선염을 주증으로하는 전신성의 질병인데, 환자의 대부분이 발병 수일전에 고양이에 물렸거나 할큄 등을 당한 경험이 있는 것이 특징이다. 고양이 할큄병은 앵무병 클래미디아와 유연관계에 있는 클래미디아 시타시 Chlamydia psittaci의 감염에 의하여 발병하는 것으로 생각되고 있다. 환자의 림프절의 유제를 피내접종하게 되면 원숭이에서 감염을 일으킨다. 마우스, 기니픽, 토끼, 개, 페레트 등에는 본 병의 감염이 아니된다.

 

 

조류의 C. psittaci 감염은 앵무새에서 처음으로 발견되었기 때문에 앵무병이라 불리고 있으며, 인체에 감염된 경우에도 같은 병명을 사용하고 있다. 학자에 따라서는, 조류에 있어서의 감염을 조류의 클래미디아병 (avian chlamydiosis)라 부르고 그 밖의 것을 오르니토시스 (ornithosis) 라고 구별하는 사람도 있다.

나. 발생 역학

일본에 있어서는, 1930년에, 큐바로부터 사들인 앵무새로부터 감염되어, 사망한 선원의 예가 최초의 예이며, 전쟁전-전쟁중을 통하여 유일한 증례로 남아 있었다. 그 후, 1952년부터 1954년까지의 기간에, 소 및 면양으로부터 포유동물계의 C. psittaci가 분리된 바 있으며, 본 클래미디아가 널리 전국적인 분포를 하고 있는 것이 확인된 바 있다. 한편, 1954년에는 조류로부터 클래미디아가 분리되기도 하였다. 한편, 인체에 있어서는, 1956년부터 1958년까지 수행된 혈청역학적인 여러가지 조사결과, 일본에 본 병이 존재하고 있음이 증명된 바 있으며, 1962년에는 환자의 혈액과 객담으로부터 본 병의 병인체를 분리한 바 있다.

1969년부터 1972년까지의 기간중 환자수가 22명 (13건)에 달하는 발생이 기록되기도 하였으며, 최근에는, 산발적으로 각지에서 발생되고 있다. 미국에 있어서는, 캘리포니아주에서 애완용 소형조류의 앵무병이 증가된 바 있다. 1976년에 67건, 1977년에 120건, 1978년에 192건, 1979년에 271건 등을 나타낸 바 있으며, 인체에 있어서의 앵무병 발생의 증가와 관계가 있었다. 캘리포니아주에서는 1965년부터 1978년 사이에 10년간 연평균 8명의 앵무병 환자가 나타난 바 있는데, 1875년부터 1978년 사이의 4년간에는 연평균 24명으로 급증된 바 있고, 1979년에는 30명의 환자가 발생된 바 있는데 그 중 1명은 사망하였다.

사람이 고양이 할큄병에 감염되면 피부에 작은 농포와 궤양이 형성된다. 그런다음, 만은 예에서 통증을 수반한 국소 림프절의 화농과 종창을 일으킨다. 통상적으로, 권태감 구토감, 발열, 사지말단의 홍반출현 등을 볼 수 있으나, 대부분의 경우 현저한 증상을 나타내지는 아니한다. 원숭이에 접종하면, 광범위한 림프선종과 피부결절을 나타내는데, 인체 및 원숭이에서의 피부결절은 병리학적으로 림프절의 염증에 의하여 나타나는 것으로 사료된다. 본증의 사망예는 알려져 있지 아니하다. 또한 고양이 자체에 `있어서도 그러한 질병을 일으키는가 하는 것에 대하여도 정확히 알려져 있지 아니하다.

 


다. 진 단

감염이 되는 것으로 생각되는 조류의 종류로는, 칠면조 오리 닭 등 가금류와 비둘기 참새 등 130종 이상의 야샹조류가 있는데, 무증상으로 경과되는 경우가 대부분이다. 그러나 스트레스가 가해지는 경우에는 발병되기도 한다. 발병된 조류에 있어서의 증상은 종류에 따라 다소 차이가 있으나, 대체로 원기와 식욕의 소실, 우모의 역립, 눈꼽, 콧물, 연변 등을 볼 수 있다. 부검소견으로는, 간과 비장의 종창과 기낭의 비후 등이다.

실험실 진단으로는, 의심이 가는 새의 비즙이나 분변, 폐, 간, 비장 등의 유제를 기니픽의 복강내에 접종하여, 접종후 7 - 10일후에 기니픽을 살처분하고, 그 비장의 유제를 3 - 8일난의 난황낭에 접종한다. 접종후 4 - 8일후에, 난황낭 재료에 대하여 김사염색 표본을 만들어 병인체 검색을 행한다. 사람에서의 진단을 위하여는, 혈청학적 기법을 이용한다. 발병시와 회복시의 켤레 혈청 (paired serum samples)을 취하여, 감염 난황낭으로부터 작제한 항원과의 사이에 보체결합 (CF) 반응을 행하여, 유의한 항체가의 상승 (4배 이상)이 인정되는 것을 감염양성으로 판정한다.

고양이 할큄병의 진단을 위하여는 가열하여 불활화 시킨 감염 림프절, 또는 종창된 림프절로부터 농을 불활화 시켜 항원을 조제한다. 그 것을 고양이 할큄병으로 의심되는 환자의 피내에 접종한다. 양성의 경우에는 튜버큘린 반응의 경우와 마찬가지로 지연형 결절반응을 항원접종 24시간 이내에 나나탠다. 한편, 고양이 할큄병 환자는 후라이테스트라고도 알려진 림프 육아종에 대한 피내반응에서는 음성성적을 나타내지만, 그의 회복기 혈청은 보체결합 반응에서 앵무병, 림프 육아종, 트라코마군 항원과 반응하여 양성의 성적을 나타낸다.

라. 예방 치료

현재, 외국으로부터 수입되는 애완조류에 대하여는 통상적인 검역이 실시되고는 있으나, 수송시의 스트레스가 본 병의 발증에 깊은 관계가 있으므로 장기간의 수송을 통한 수입조류에 대하여는 보다 엄중한 검역을 실시하여야할 필요가 있다. 애완조류에 예방적으로 테트라사이클린계의 항생물질을 투여하여, 인체에의 감염을 미연에 방지하는 것이 시도된 적이 있으나, 내성균의 출현 가능성과 관련하여 보다 신중하고 충분한 주의를 필요로 한다. 인체에의 감염에 대하여는, 페니실린, 테트라사이클린, 에리쓰로마이신 등의 투여가 유효하다. 인체용 백신은 아직까지 개발되어 있지 아니하다.

2. 양의 유행성 유산증 진단의 국제표준

양의 클래미디아증 (ovine chlamydiosis) 또는 암양 클래미디아성 유산증 (chlamydial abortion of ewes)이라 알려진 유행성 유산증 (enzootic abortion)의 진단은, 유산태아 또는 갓 유산한 암양의 질분비물에서 Chlamydia pastittaci 를 확인하거나 가능하다면 분리하면 된다. 체액성 면역반응은 유산후에 확인 될 수 있다. 양 뿐만아니라 산양에도 감염될 수 있다. 소형반추동물의 C. psittaci는 인수공통 병인체이므로 조심스럽게 취급되지 않으면 아니된다. 임신부는 특히 감수성이 높다.

Chlamydia psittaci는 암양에서 유행성 유산증을 유발하며 인수공통 전염병으로 잠재력이 있으므로, 적절한 미생물학적 차폐시설에서 취급되지 않으면 아니된다. 감염된 암양은 유산시나 분만시에 다량의 전염성의 클래미디아를 방출하는데, 특히 태반과 자궁의 배출시 많게된다. 사람의 감염은 이러한 감염원이나 부주위하게 취급된 실험실의 미생물 배양액으로부터 이루어 질수 있으며, 증상은 준임상형 감염으로부터 유행성독감 양 질병까지 다양하다. 양 C. psittaci에 의해서 야기된 사람 태반염과 유산 등의 최근 입증된 사례는 임신한 여성은 특히 위험하며, 감염원에 노출되지 말아야한다는 것을 보여준다.

가. 병인체 동정

(1) 도말표본

축군의 임상적인 병력과 유산된 태아의 병변이 유행성 유산증을 암시하는 경우에는, 감염된 융모막 융모 (chorionic villi)나 근접 융모막으로부터 만들어진 도말표본을 현미경으로 검사함으로써 진단할 수 있다. 몇 몇 염색방법은 진단에 만족할 만하다. 예를들면, Modified Machiavello, Giemsa, Brucella 감별 또는 변형된 Ziehl- Neelsen 염색 등이다. 후자방법에 의해서 염색되고, 고배율 현미경하에서 양성인 경우 많은 수의 구형소체는 세포 파편의 푸른색 배경에 대비되어 빨강색으로 염색되어 하나의 덩어리로 보인다. 암시야 경검하에서, 기본소체들은 엷은 녹색이다. 태반물질이 이용될 수 없는 경우, 도말표본은 24시간 이내에 유산한 암양의 질 면봉이나 바로 유산한 새끼양이나 암양의 배속에 있는 새끼양의 습윤한 양털로부터 만들어 질 수 있다.

일반적으로, 위와같은 과정은 형태와 염색특징면에서, C. psittaci는 rickettisia 인 Coxiella burnetii와 유사한데, C. burnetii는 동물의 Q 열로 유산을 일으킬 수 있다. 클래미디아-유발 태반병리의 확실한 병력이나 증거가 부족한 경우에는, 이 두 미생물을 구별하는데 주위를 기울여야 한다. C. psittaci 와 C. burnetii 사이의 항원성 차이는 혈청학적으로 검출될 수 있다. 특이적인 항혈청이나 단클론성 항체를 이용한 면역형광 검사가 C. psittaci 의 동정에 사용될 수도 있다.

(2) 조직절편

세포내의 클래미디아 봉입체는 Bouin이나 Carnoy와 같은 용액으로 적절하게 고정시킨 표적조직으로 부터 채취된 박층 절편 ( 4㎛)을 Giemsa 염색함으로써 확인 할 수 있다. 더 확실한 결과는 면역학적 염색방법을 통해서 얻을 수 있다. 직접 효소면역 방법은 빠르고, 간편하다.

(3) 분리

C. psittaci는 발육계란이나 세포배양으로 부터 분리될 수 있으며, 세포배양은 새로운 균주 분리에 대한 선택적인 기법이다. 조직표본 재료 - 즉 이환된 태반엽, 태반막, 태아 폐나 간 또는 질 면봉재료와 같은 조직표본은 분리과정이 시작되기전에 시간이 지체되면 안니되므로, 짧은 기간일지라도 적절한 운송용 배지내에 보존하여야 한다. 가장 좋은 배양액은 10% 태아 송아지 혈청, 항생물질 (streptomycin과 gentamycin은 괜찮지만, penicillin은 안됨)와 곰팡이 억제제가 첨가된 sucrose- phosphate- glutamate 배양액이다. 1:10의 조직-배양액 비율이 일반적으로 사용된다. 다른 방법으로, 약 1g의 조직을 운송용 배양액 8ml 안에서 무균모래로서 마쇄시키는 것이다.

계태아 (Chick embryos): 검사용 시료는 200㎍/ml streptomycin (penicillin은 안됨)을 포함한 nutrient broth내에 10% 부유액으로 준비된다. 즉 부유액의 0.2ml을 6 - 8일된 태아의 난황에 접종하고 이 태아를 37 에서 며칠 간 더 배양한다. 감염된 태아는 접종 후 4 - 13일 사이에 죽는다. 이러한 혈관이 형성된 난황낭막으로 부터 준비된 도말표본은 많은 수의 기본소체를 나타낸다.

조직배양 재료(Cell cultures): 양의 C. psittaci는 다양한 형태의 세포로부터 분리될 수 있으나, McCoy, BEM 또는 BHK 세포가 가장 일반적으로 사용된다. 확실한 진단을 위해서는, 배양된 단층세포를 2 105 cell/ml의 농도로 발육배지내에 부유시킨다. 부유액 2ml를 하나의 16mm 카버슬립을 가진 편평한 바닥 유리 Universal 병 (flat-bottomed glass Universal bottle)에 넣는다. 카버슬립 융합성의 단층세포는 37 에서 24시간 배양 후 얻어진다. 성장배지를 제거하고, 2ml의 검사용 접종세균을 접종한 후, 접종세균이 카버슬립 단층세포에 잘 감염할 수 있도록, 30분간 2,500 g에서 원심분리를 한다.

2 - 3일 간의 추가 배양 후, 카버슬립 단층세포를 메탄올로 고정하며, Giemsa로 염색하거나 Gimenez에 따라 염색한다. 메탄올 고정 후, 감염된 배양재료를 호염기성 (Giemsa) 또는 호산성 (Gimenez) intracytoplasmic inclusions을 포함한다. 항원제조를 위한 C. psittaci 배양시에는 비슷한 과정이 사용된다. 면역형광기법도 또한 사용될 수 있으며 동등한 효과가 있다. 클래미디아 활성은 감염전이나 감염후 배양된 세포에 대한 화학처리에 의해서 더 증가될 수 있다. 전염성 접종세균에 감염될 때 첨가될 수 있는 다양한 물질로는 유지배지에서 1㎍/ml 농도의 cycloheximide, 감염 전 5분 동안 1㎍/ml 농도의 emetine, 감염 전 3일 동안 80㎍/ml 농도의 5-iodo-2-deoxyuridine이 있다. 사전에 조건이 조절된 세포가 이용될 수 없으면, 후자의 분리과정은 성공적인 분리가 되기 위해서는 더 오랜시간을 필요로한다.

나. 혈청학적 진단기법

보체결합 반응 (CF)은 가장 널리 이용되는 기법이다. 집단이 기준인 경우, CF 진단은 예방접종이나 감염의 증거를 찾을 수 있을것이다. 임신 마지막달의 태반감염인 경우와 유산을 자주 수반하는 chlamydaemia인 경우에 감염은 대체로 확실하다. 결과적으로, 유산시와 유산후 3주가 지난후에 채취된 한쌍의 켤레혈청 (paired sera)은 연역적 진단에 기초를 제공할 수 있는 증가하는 CF 항체가를 밝혀줄 수 있을 것이다.

C. psittaci와 일부 Gram-negative 세균 (예; Acineto bacter)간의 항원성 교차반응은 낮은 빈도의 위양성 CF test 결과를 초래할 수 있다. 그러므로 개별동물에서 1:32 보다적은 항체가는 비-특이적인 것으로 간주해야 한다. 항원은 계태아로부터 얻어진 심하게 감염된 난항낭막으로부터 준비되는데, 계태아는 미생물을 야외재료로 부터 분리하기위해 사용한 방법과 같은 방법으로 배양된다. 세절하고, 마쇄된 막은 pH 7인 인산완충액 (phosphate buffer)에서 멤브레인 당 2ml의 비율로 부유시킨다. 잔사를 제거한 후, 상층액을 4 , 10,000 g에서 1시간동안 원심분리를 한 후, 그 침전물을 소량의 식염액에 재부유시키고 이것의 도말표본이 클래미디아의 높은 수확을 확인하기 위해서 검사한다. 그 부유액을 20분동안 끓는 항온수조내에 담가두거나 가압멸균하며, 그리고 보존제로서 소디엄 아자이드 (3% 까지)를 첨가한다.

항원은 또한 C. psittaci로 감염된 세포배양으로 준비될 수 있다. 감염된 단층세포를 pH 7.6인 PBS에 부유시키고, 그 세포는 균질화나 초음파 처리에 의해서 파괴시킬 수 있다. 큰 잔사를 제거하고, 연속적인 과정은 감염된 난황낭으로 부터 항원준비 과정과 같다. 어떤 경우에도, 표준 보체와 항혈청을 가지고 한 CF 진단은 각 생산단위별 항원에 대한 적절한 희석체계를 확립할 수 있을 것이다. 클래미디아 혈청학에 적용되는 다른 진단방법은 라텍스 응집반응, 수동형 혈구응집 반응 그리고 ELISA등이 있다. 그러나 아직까지, 어떠한 방법도 보편적인 적용을 할 수 있을 정도로 적절하게 표준화되어 있지는 아니하다.

3. 조류의 클래미디아증 (앵무병) 진단의 국제표준

조류의 클래미디아증 (Avian chlamydiosis; AC)의 병인체는 Chlamydia psittaci이다. 사람과 앵무새에서의 질병은 앵무병 (psittacosis)으로 불리었고, 사육되는 동물이거나 야생조류의 경우에는 나중에 ornithosis로 불리었다. 이 두 질병은 비슷하다. 그러나 포유류에서의 클래미디아증은 약간 다른 병인체에 의해 일어난다. AC 주는 사람에서 심각한 병증을 유발하고 죽음에 이르게 할 수 있다. 사람에서의 ornithosis가 psittacosis보다 경증으로 진행된다. 칠면조로부터 전염된 질병은 앵무새로부터 유래된것 보다 종종 중증으로 경과한다. AC의 실험실 진단은 병인체의 분리와 동정을 포함하는데 조직에서의 병인체의 확인이나 전형적인 임상증상과 함께 특이 항체가의 4배 증가 등이 포함된다. 집단 단위에서의 임시진단에는 임상증상과 높은 항체가의 높은 빈도 출현 등이 포함되어야 한다.

병인체는 조류에서 전신적으로 치명적인 질병을 유발한다. 임상증상은 심각한 정도가 크게 변화하는데 이것은 조류의 나이, 종과 병인체의 주에 의해 이루어 진다. AC는 혼수상태, 고온, 비정상적인 분비, 비즙과 안 분비물 그리고 난 생산량 감소등의 증상을 보인다. 치사율은 30%까지 이른다. 애완조류에서 빈발하는 임상증상으로는 식욕감퇴, 체중감소, 설사, 황색 배설물, 부비강염 그리고 호흡기 곤란 등이 있다. 많은 조류, 특히 늙은 앵무새에서는 임상증상을 보이지않을수도 있는데 이들은 오랜 기간 병인체를 방출한다. 감염된 조류를 부검하게 되면 비장과 간장의 비대, 섬유소성의 기낭염, 심낭염 그리고 복막염 등을 보인다.

가. 병인체 동정

AC의 실험실 진단은 일반적으로 병인체의 분리와 동정에 의해서 이루어진다. 증식하는데는 살아있는 세포가 요구되기 때문에 실험동물 접종이나 세포배양이 필요하다.

(1) 표본의 채취와 처리

채취할 표본은 임상증상에 의존해서 무균적으로 채취한다. 오염된 세균은 클래미디아의 분리를 방해할 수 있다. 급성 감염을 보이는 경우에는 병변조직이나 또는 근처의 감염성, 섬유소성의 삼출물, 눈 또는 비강 분비물, 신장의 혈액과 조직, 폐, 비장과 간등을 채취한다. 설사증상을 보일때는 결장내 분변과 분비물을 배양해야한다. 살아있는 조류에서는 전혈, 장관분비물, 기관 면봉채취물, 결막 도말표본과 복강 삼출물 등을 채취한다. 칠면조에서의 최근의 병리학적 연구결과에 의하면, 측비선(lateral nasal gland)은 초기에 감염되어서 최소한 50일을 감염상태를 지속하는 것으로 알려져 있다.

그래서 134마리의 코카틸 앵무새에서 구강내 면봉채취물과 배설물 그리고 배설강 면봉채취물 을 비교해 본결과 한가지 이상의 방법에 의해 양성병인체 배양이 이루어 졌는데 36.7%가 양성으로 판정났다. 이 중에서 구강내 면봉채취물은 83.7%, 배설물에서는 46.9%, 배설강 면봉채취물은 38.8%의 양성을 보였다. 비슷한 결과가 칠면조에서도 보였다. 이로써 병인체 분리시 구강내 면봉채취물의 중요성과 질병 전파시에는 상부호흡기와 공기전염의 가능성등이 중요시된다. 표본의 운반과 저장시에 감염성을 잃지 않기 위해서 표본의 적절히 다루어야한다.

리케치아에 적용되는 sucrose-phosphate-glutamate (SPG)배지가 클래미디아의 야외 분리주를 운반하는 데 효과적인 것으로 증명되었다. 이 배지의 성분들로는 SPG 완충액 (sucrose 74.6 g/liter; KH2PO4 0.512 g/liter; K2HPO4 1.237 g/liter 그리고 L-glutamic acid 0.721 g/liter)을 멸균 소독하고 여기에 우태아 혈청 (10%), 밴코마이신과 스트렙토마이신 (100ug/ml) 그리고 니스타틴과 겐타마이신 (50ug/ml)을 첨가한다. 항생물질 첨가로 인해서 표본이 불안정한 온도에서 운반되더라도 오염도를 줄일 수 있게된다. 이 배지는 실험실에서 희석액으로도 사용이 가능하고 클래미디아를 동결시킬때도 사용된다.

오염된 표본은 동물에 접종하거나 세포배양할때 전처리 과정을 필요로한다. 여기에는 항생제 처리, 낮은 속도의 원심분리와 함께 항생물질 처리, 그리고 여과와 함께 항생제 처리하는 등의 세가지 방법이 있다. 클래미디아에는 해를 끼치지 않는 여러가지 항생제가 알려져있다. 표본을 스트렙토마이신 (1mg/ml), 밴코마이신 (1mg/ml), 카나마이신 (1mg/ml)가 들어 있는 PBS (pH 7.2)에서 균질화 시킨다. 겐타마이신 (200ug/ml)도 사용할 수 있다.

효모와 곰팡이의 증식을 억제하기 위해서 암포테리신 B를 사용한다. 기타 항생제들도 사용될 수 있지만 페니실린, 테트라사이클린, 클로르마이세틴 등은 클래미디아의 성장을 억제하기 때문에 사용해서는 안된다. 오염도가 낮을 때에는 표본을 종란이나 기니아 피그,마우스,조직배양 세포에 접종하기 전에 항생제를 첨가해서 균질화 한다. 표본을 접종전 24시간 동안 항생제와 함께 방치하기도 한다. 분변등의 심하게 오염된 표본은 항생제와 함께 균질화 한 후 1000 - 2000 g에서 30분간 원심분리한다. 표면층과 최하층은 버린다. 상층액을 취해서 다시 원심분리한다. 상층액을 접종에 사용한다. 오염이 남아 있으면 평균 구멍크기가 450 - 800um되는 여과기로 여과한다.

(2) 세포배양으로 부터의 분리

세포배양은 가장 편리하게 C. psittaci를 분리할 수 있는 방법이다. 사용될 수 있는 세포주들로는 McCoy, HeLa, VERO, 그리고 L 세포들이다. 이 세포들은 5-10%의 우태아 혈청과 항생제가 첨가된 배양액에서 자란다. 조직배양에 쓰이는 기구들을 선택할 때는 다음 사항들을 염두에 두어야한다.

i) 클래미디아는 직접 형광항체법이나 기타의 염색법에 의해 동정될 수 있다.

ii) 접종액은 감염성을 증가시키기 위해서 단층세포에 원심분리한다.

iii) 표본은 분리의 민감도를 증가시키기 위하여 6 - 7회 맹목계대

(blind culture)를 실시한다.

iv) 표본은 계대할때마다 2-3회 검사한다.

v) 클래미디아는 사람에 가염을 일으킬수 있다.

1 드램 각병(3.7ml, 15 x 45mm)이나, 12mm 커버슬립이 들어있는 병등의 작은 평면바닥 병이 여기에 적합하게 사용된다. 4 - 6개의 병에 각각의 표본을 접종하면 시간간격을 두고 고정하고 염색할 수 있을 뿐아니라 접종후 6일후에 음성으로 보이는 표본을 다시 계대배양 할 수 있게 된다 (표1 참고).

클래미디아는 정상적으로 분열하는 세포로 부터 분리될 수도 있다. 그러나 분열을 멈춘 세포에서는 더 많은 영양분을 클래미디아에 공급할 수있게 되며, 더 오랫동안 세포들을 관찰할 수 있는 장점을 갖는다. 숙주세포의 분열은 방사선이나 흔하게는 세포독성을 띠는 화학제에 의해 억제될 수 있다. 이러한 화학제 들로는 5-iodo-2-deoxyiodine, cyto-cholasin B, cycloheximide와 emetine hydrochloride 등이 있다. cycloheximide는 단층세포에 접종할때 0.5-2.0ug/ml의 비율로 배지에 첨가한다. Emetine은 처리 후 제거해서 배지로 교체한다. 이것이 장점이다. 단층세포는 5분간 0.5ug/ml의 emetine으로 처리하며, 이 후에 배지로 교체되는데 단층세포는 접종할 수 있는 준비가 되게된다. 이러한 화학제가 클래미디아의 증식에 미치는 효과는 주 특이적이기 때문에 대부분은 이러한 처치에 의해서 증식이 활발해지지만 그렇지 못한 주들도 있다.

세포배양시 클래미디아의 감염율을 높이기 위한 다양한 방법들이 있다. 접종액을 37oC, 1000 - 3000 g에서 30 - 90분간 원심분리해서 접종액을 제거하고 세포분열 억제제가 첨가된 배지로 교체해서 37 - 39oC에 배양시킨다. 배양액은 적절한 염색법에 의해서 정기적으로 클래미디아를 확인한다. 이것은 2 - 3일째와 5 - 6일째에 실시한다. 6일째에 음성으로 나타나면 수확해서 계대배양한다 .

표 2. 조직배양 세포에서의 클래미디아 분리방법

배양세포를 염색하기 전에 배지를 제거한후 PBS로 세척한다. 아세톤으로 2-10분 고정하는데 고정시간은 사용된 조직배양병에 달려있다. 아세톤은 플라스틱을 녹일수 있으므로 50% 아세톤과 50% 메탄올을 사용한다. 클래미디아 감염을 확인할 수있는 많은 염색법들이 있다. 그중에서 면역형광 항체법이 선호된다. 형광물질이 표지된 클래미디아 양성혈청을 감염세포에 37oC의 숩식항온기에서 30분간 반응 시킨다. 커버슬립을 PBS로 3회 세척후 공기중에서 말리고 현미경으로 검사하면, 밝은 녹색의 형광을 발한다.

단클론 항체를 이용한 상품들이 유용하며 아주 특이적으로 반응한다. 다클론 항체를 이용해서 콘주게이트를 만들 수도 있지만 이때는 특이적인 높은 역가의 항혈청을 준비해야한다. 다틀론항체는 토끼, 기니픽, 면양, 염소 등을 이용해서 생산할 수 있는 데 면양과 염소는 많은 양과 높은 역가의 혈청을 쉽게 얻을 수 있는 좋은 동물이다. 콘주게이트는 기존의 기술을 이용해서 만드는 것이 가능하다. 클래미디아 감염세포는 간접 형광항체법과 면역효소법을 이 해서도 염색할수 있다. 그기고 김사, Gimenez, 마키아 벨로 염색에 의한 직접 염색도 가능하다. 면역형광 항체법이외의 방법들은 광학현미경을 이용해서 관찰할 수 있는 장점들이 있다.

(3) 주/종 사이의 차이점 (Differentiating between strain/species)

C. psittaci군은 많은 수의 특이적인 주를 포함한다. 다양한 주에 의해 발생된 증상은 아주 특이적이며, 자연숙주도 특이적으로 감염된다. 단클론 항체를 이용해서 분리주를 분류하면 효과적이다. 양에서 유산을 일으키는데 특이적인 단클론 항체는 관절염을 일으키는 주에는 반응을 하지 않는다. 칠면조의 독성이 있는 주와 앵무새 주, 양의 유산주에 대한 단클론 항체는 만들어 졌다. C. psittaci 스트레인을 면역 형광법으로 형별하는 데에는 아직은 서로 다른 스트레인간에 한정되고 있으며, 특이 단클론성 항체를 꼭 필요로하게 된다. 발육란 계태아를 이용해서 클래미디아의 초대 분리를 수행한다.

이 때는 6 - 7일령의 종란 난황낭에 0.5ml를 접종한다. 37oC에서 보다는 39oC에 배양하는 것이 좋은데, 왜냐하면 클래미디아의 증식은 고온에서 크게 증가되기 때문이다. 병인체의 증식은 접종 후 대개 3-10일에는 태아가 죽는다. 만약 죽지 않으면 음성 판정을 내리기전에 두번의 맹목계대를 실시해서 최종 판정을 내린다. 클래미디아가 감염되면 난황막에 전형적인 혈관 충혈이 나타난다.

이것을 수확 후 20% (w/v)로 균질화 시킨후 분리주를 보존하기위해서 냉동시키거나 다른 종란 또는 배양세포에 접종시킨다. 감염된 난황막으로 부터 항원을 수확해서 병인체를 동정한다. 이 병인체는 보체결합반응에 의해 클래미디아 공통 항체를 검출하거나 다른 혈청학적 방법에 의해 검사한다. 단층 배양세포에 20%의 난황막 수확물을 접종 48-72시간 경과 후에 직접 형광항체법에 의해 검사한다. 전형적인 봉입체의 모습은 세포내에서 둥근 또는 모자모양의 모습을 띠고 있다.

칠면조에 독성을 나타내는 주는 때때로 봉입체를 깨뜨린 후 세포내에 퍼지는 경우도 있다. 공통항원에 대한 검사는 단순히 병인체가 클래미디아임을 증명하는 것이고 C. trachomatis와 C. psittaci를 구별하지는 못한다. 현재로서는 여러 종들의 차이는 생화학적 시험들에 의해서 구별된다. 이 시험은 글리코겐의 존재나 sodium sulfadiazine에 대한 감수성을 검사하는 것이다. 탄수화물이나 글리코겐을 5% potassium iodide-iodine으로 여러시간 동안 염색 함으로서 존재여부를 알수있다. C. trachomatis는 어두운 갈색으로 염색되는 탄수화물 함유 미세 집락을 형성한다.

종란에서 C. trachomatis의 증식은 각각의 난황낭에 1.0mg의 sodium sulfadiazine을 접종전에 주사하면 대조군에 비해서 최소한 1/100 만큼 역가가 떨어진다. 그러나 C. psittaci는 sodium sulfadiazine에 영향을 받지 않는다. C. psittaci의 여러 주에 대한 단클론 항체가 유용할 때에는 C. psittaci를 형별하는 것 뿐 아니라 C. trachomatis로부터 구별하는 데도 쓰일 수 있다. 많은 실험실에서 이런 항혈청을 생산하고 있다. C. psittaci의 미세 집락은 800배 이상의 위상차 현미경으로 신선한 삼출물에서 동정된다. 그러나 마이코플라즈마도 비슷한 구형의 모양을 보인다. Gimenez 염색이 병인체를 엷은 빡강으로 염색하지만 다른 세균들도 쉽게 염색된다.

조직학적 시험들도 클래미디아가 감염된 세포를 동정하는 데 쓰일수 있다. 플라스틱에서 처리된 조직절편이 좋은 결과를 보이는데 표본은 4um 이하의 두께로 잘라져야 한다. 세포학적, 조직학적 방법보다는 직접 형광항체법과 면역효소법이 더 특이적으로 번응한다. 최근까지 형광물질이 표지된 항체는 상엽적으로 판매되지 않았고 스스로 준비할 수 있는 실험실도 많지 않았다. 이제는 단클론 항체가 표지된 것을 가지고 조직 도말표본, 삼출물이나, 임상적 조직학적 재료들에서 클래미디아를 빠르게 검사할 수 있게 되었다.

나. 혈청학적 진단기법

(1) 보체결합 반응

보체결합 반응은 클래미디아의 공통항원에 대한 항체를 검색할수 있다. 이 시험의 결과는 크게 차이가 나지만 조류의 혈청은 항보체 효과를 띠기 때문에 변형된 방법을 사용한다. 조류의 클래미디아 항혈청을 포유류의 클래미디아 항혈청이 존재하는 가운데 검사하는 간접 형광항체법이 있다. 만약에 정상적인 수탉 혈청을 기니픽 보체를 고정하는데 돕기 위해서 첨가한다면 직접 형광항체법도 조류 혈청을 검사하는 데 쓰일 수 있다. 혈청을 비동화하면 조류 항원,항체복합체가 기니픽 C1 보체를 활성화 할 수 없게 한다.

정상적인 조류혈청의 첨가는 지금도 조류혈청을 검사하는 데 쓰여진다. 직접미세 CFT도 만족스러운 결과들을 나타낸다. 이 시험에 쓰이는 항원은 조직배양에의해서 쉽게 준비될 수 있으며 이 미세 CFT는 몇개의 표본을 검사하는 데 쓰인다. 많은 방법들이 CF 항원을 만드는데 사용된다. 이것은 크게 조직배양에 의한 클래미디아의 증식, 불활화, 항원의 부분적 정제, 기계적 파괴와 적당한 완충액에의한 희석들을 포함한다.

감염된 세포에서 세포변성 효과가 관찰되면 클래미디아와 세포파편들을 수확한다. 페놀을 최종농도 1.0%가 되게 첨가해서 불활화시킨 후에 37oC에서 24시간 놓아둔다. 10,000 g에서 1시간 원심분리 한 것을 1.0% 페놀과 1.0% 글리세롤을 포함한 veronal-buffered saline (pH 7.2)에 원래 용적의 1/10로 채워준다. 이것을 4oC에서 1분씩 3회 균질화한다. 이것을 100 g에서 5분간 원심분리해서 세포파편들을 제거하고 상층액을 적당한 농도로 희석한다.

두번째 방법은 앵무새 주에 감염된 L 세포주로 부터 CF 항원을 만든다. 세포 배양액을 버린다음 세포를 56oC에서 40분간 가온한다. 세포를 증류수로 터뜨린다음 클래미디아를 초음차로 파과한다. 그리고 나서 CF희석액에서 등장액으로 만든다, 항원을 감염후 회복기에 있는 면양혈청을 가지고 시험해 본다음 직접 미세 CFT에서는 2단위를 사용한다. CF항원은 감염된 낭황낭을 이용해서 만들수도 있다 이것은 세포배양에 의한 항원제조 보다 더 까다롭다.

이 항원은 포유동물과 비둘기 혈청을 검사하는데 배우 효과적이다. 왜냐하면 기타 조류의 혈청들은 간접 CFT아 변형된 직접 CFT에 의해 이루어지기 때문이다. 대분분의 조류혈청에서의 CFT시험상의 문제점 때문에이 방법은 실험실에서 다른 방법들을 수행할 준비가 되어있지 않은 경우에 항원생산의 한 방법으로 쓰인다. 보체결합 항체는 보통 감염 후 7-10일 안에 나타난다. 양성판정을 위해서 CF 항체의 4배 이상 증가가 요구된다. 군단위에서 혈청학적 방법에 의한 추정진단이 전형적으로 임상증상을 보이는 경우와 대부분의 조류가 1: 64 이상의 항체가를 보일 경우에는 가능하다.

(2) 기타 시험방법

기타 혈청학적 방법들이 개발되었지만 이들의 특이성은 충분히 검토되지 않았다. 클래미디아 공통항원에 대한 ELISA는 CFT보다 빠르고 민감성이 뛰어나며 또한 이것은 자동화 될 수 있다. C. trachomatis와 C. psittaci에 대한 항체검사 ELISA시험에서 대부분의 경우 CFT대신에 사용될수 있음이 밝혀 졌다. 그러나, 좀더 광범위하게 시험되고 이것의 사용에 관한 표준방법의 작성이 이루어 지지않고 있다. 다른 방법들로는 한천 젤 면역확산법과 latex 응집반응 (LA)이 있다. 면역확산법은 CFT보다 덜 민감하게 작용한다.

LAT는 C. psittaci에 대한 항체를 쉽고 빠르게 검사한다 (15). Latex 구슬은 정제된 클래미디아 항원으로 둘러 입힌 다음 유리 플래이트에서 실험할려는 혈청과 함께 충분히 혼합한 다음, 응집력을 증가시키기 위해서 2분간 회전시킨다. 이 실험에 의해 배경은 어둡게 보인다. 양성반응을 보이는 혈청들은 비 특이적인 응집을 제거하기 위해서 항원이 싸여지지 않은 구슬에서 다시 실험을 실시해야 한다. LA와 직립 CFT는 72.8% 일치하며 LA는 직접 CFT에 비해서 39.1%의 민감도와 98.8%의 특이성을 보인다. 특이성의 정도가 말해 주듯이 이 시험에 의해 급성과 최근 감염을 검사할 수 있다.

4. 클래미디아증 예방백신의 국제표준

조류에서 사용할 수 있는 클래미디아증 백신으로 상품화되어 있는 것은 없다. 백신을 생산하기 위한 시도는 부분적으로 성공한 바 있으며, 대부분은 농축된 현탁액에 포르말린으로 불활화시킨 사균백신이 있다. 면역원성은 세포성 면역반응에 관계된 것으로 보이지만 백신의 생산에 있어서 이 방향으로 유도되고 있지는 않다.

양의 클래미디아증에 대한 생물학적 제제로서는, 불활화 예방백신이 감염된 난황낭 또는 세포배양에서 제조될 수 있다. 화학적으로 유도되고 온도에 민감한 변이주를 양 유산 스트레인인 C. psittaci로 부터 얻어져서, 생균백신으로 시험된 바 있다. 어떠한 부작용도 감염된 양이나 염소에서 발견되지 않았으며, 실험적인 감염결과는 좋았다. 이러한 시도는 끝나지 않았는데, 병원성으로 전환 될 위험성이나 사람에거 감염될수 있는 잠재적인 위험을 제거할 필요가 있을 것이다. 체액성과 세포성 면역이 모두 중요하다.

가. 종균주 관리

(1) 특성

선택된 배지에서 완성하게 자란 하나나 2이상의 양 유산 분리주가 적합하며, 종균 (seed stock)의 초기 계대가 확립될 수 있다. 다른 방법으로는 복합계대에 의하여 계태아에서 얻어진 분리체가 사용될수 있다. 이것은 더많은 배아가 백신생산에 사용되는 것을 가능케 해준다.

(2) 배양

낮은 계대의 분리주의 경우에는, CF 항원의 준비에 대해서 기술된 과정이 적절하게 채택되어, 대량생산을 위해 증폭된다. 일단 최종수확 부유액이 얻어지면, 액상부분을 감염역가 검정을 위해 제거한다. 대량 배양물은 포르말린으로 처리되어 0.4%의 최종농도가 되고, 멸균시험에서 완전한 불활성을 확신시킬 때까지 보관된다.

(3) 예방백신으로서의 유효성

많은 수의 수정란이나 세포배양체를 접종하기전에, 종균주 (seed stock)의 생존능력과 오염방지가 확실하게 이루워져야 한다. 독립적으로 관리할 수 있는 경우에는 한꺼번에 전체수확 을 얻는것이 편리할 수 있다. 그와 같은 경우에 각 제품의 액상부분의 감염성은 각각이 그 요구를 맞출수 있도록 개별적으로 적정되어야 한다. 냉장조건하에서 보관하여야 한다.

나. 제 조

불활화된 수확물을 원심분리하고, 사전 불활성 감염역가가 약 108 감염 (단위/ml)을 나타내는 부피까지 0.2% formalin을 함유한 phosphate buffer 용액으로 재부유한다. 일반적으로, 수용액성의 부유액을 oil adjuvant와 직접 혼합하거나 potassium alum〔AlK(SO4)212H2O〕도 침전시킨 후 혼합한다. 0.01% thiomersal과 같은 첨가제를 또한 첨가할 수도 있다.

다. 공정중 관리

C. psittaci를 적절하게 발육시키는 것, 배양기질에의 외부감염을 피하고, 완전한 불활화 및 생물재해 위험성에 관하여 제조자에게 인지시키는 것 등이 주요 요건이다.

라. 생산품 관리

제조된 백신의 각 개별적인 생산단위는 멸균도 및 안전성과 효능에 대해서 검사받아야 한다.

(1) 멸균도

멸균도 시험과 생물학적 물질의 오염방지에 대한 검사방법이 일반정보 (General Information)에 언급되어 있다.

(2) 안전성

표준용량 (일반적으로 1.0ml)을 2마리나 2이상의 양에 피하접종하여 어떠한 계통적 반응도 유발시키지 않아야 한다. 그러나 유성 (oil-adjuvant) 백신은 접종부위에 해롭지 않은 부종을 야기할 수도 있다.

(3) 효능

현재에는, 효능시험 전에 백신을 맞지 않은 양의 피하에 1ml의 백신을 접종하여 나타나는 혈청학적 반응으로 판단한다. 백신접종전에 채취한 혈액 표본과 백신접종 28일이 지난 후 채취한 혈액 표본을 비교한다. 결과적으로, 효능은 실험적 공격접종이나 야외시험의 검정에서 판단되어야 한다. 그러나 아직까지 어떠한 시험관내 방어효율의 상관성은 확립되어 있지 아니하다.

(4) 면역지속 기간

확실한 데이타는 없으나, 노출위험의 정도에 따라, 1 - 3년 후에 재접종하는 것이 권장된다.

(5) 안정성

냉장상태 (5 +/- 3oC)로 보관된 백신은 최소 1년간 안정한 상태를 유지한다. 사용전에 반드시 24시간 동안 실내에 보존하고 백신을 뽑아내기 직전에 용기를 세차게 흔들어 주어야 한다.

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