포도구균 독소의 검출법


1. 포도구균 및 포도구균 독소의 정의


포도구균은 사람이나 동물의 화농성 질환을 일으키는 균으로 유명하며, 포도구균 독소는 포도구균에 의해 산생된 일종의 균체외독소인 enterotoxin으로서, 사람은 이 독소가 함유된 식품을 섭취함으로써 포도구균 식중독이 발생하게 된다.

이 균은 사람이나 동물의 화농성 병소에 존재할뿐만 아니라 건강한 피부와 비강에도 존재하며, 더우기 먼지, 쓰레기, 하수등 자연환경에 널리 분포되어 있으므로 식품이 이 균에 오염될 기회는 대단히 많다.

포도구균식중독의 최초기록은 Barber(1914년)가 목장우유로 인한 급성위장염 발생을 필리핀 과학잡지에 보고한 것이 최초이며, Dack 등(1930년)이 포도구균으로 오염된 식품섭취로 인한 식중독은 단백질의 부패로 인해 생기는 유독물(Ptomine Poisoning)에 의한 것이 아님을 밝힘 으로서 이후 포도구균식중독(Staphylococcal food poisoning)으로 불리게 된 이래, 지금까지도 세계 도처에서 끊임없이 발생 보고되고 있으며 국내에서도 흔히 발생되고 있는 것으로 알려져 있다.


2. 포도구균 독소의 특징


포도구균식중독의 원인물질인 enterotoxin은 분자량이 약 28,000 정도이며 열에 대한 안정 성이 매우 높아 가정에서의 일반적인 요리시간 및 온도에서는 완전파괴되지 않으므로, 이톡신으로 오염된 식품을 섭취시에는 위험을 초래할 수 있다. Enterotoxin 은 혈청학적 으로 A ∼ F 형이 보고되었으나 F 형은 진정한 enterotoxin인지는 분명치 않으며, 식중독 발생은 주로 A 형 또는 A 와 D 형 enterotoxin 에 의해 많이 발생되는 것으로 알려져 있다.

본 식중독의 증상은 여러가지가 있으나 가장 흔한 주된 증상은 구토와 설사로서 enter- otoxin 이 장에 직접적인 작용에 기인하는 것으로 알려져 있으며 개체에 따라 차이가 있으나 1 - 25㎍ 수준이면 실제 증상을 나타낼 수 있는 량으로 알려져 있다.


3. 포도구균 독소의 검출법 및 포도구균의 독소산생성


본 연구에서는 포도구균 식중독의 원인물질인 enterotoxin의 검출법 확립과 포도구균의 독소산생능 시험을 조사하였는 바, 그 결과를 요약하면 다음과 같다.


1) 포도구균 독소의 검출법


① Microslide gel double diffusion test

o 이 방법은 미국 FDA의 공인방법으로서 Bennett 및 Untermann의 방법에 준하여 실하였다.

o Enterotoxin 및 anti - enterotoxin : 이 시험에 사용한 enterotoxin 및 anti - enterotoxin은 본 연구실에서 조제 사용하였으며, enterotoxin의 정제과정중 각 분획의 enterotoxin 확립에 사용된 enterotoxin 및 anti - enterotoxin 은 Serva feinbiochemica(Heidelberg) 제품을 사용하였다.

o 본 실험에 사용한 플라스틱 template는 주문제작한 것으로서 well의 직경은 1.6㎜, 높이는 4.75㎜, 중앙well에서 주변well까지의 거리는 4.50㎜, 주변wel 간의 거리는 7.15㎜였다.

슬라이드의 1차 코팅용 agar는 bacto ager(Difco) 1.2%를, gel diffusion agar 로는 noble special agar(Difco) 1.2%를 사용하였다. 침강선의 관찰은 실험 조작이 끝난 다음 실온에서 48시간 경과된 후 침강선 형성을 확인하였으며, 필요시는 0.1% thiazine red 염색액(용매 : 1% acetic acid)에 5∼10분간 염색 하여 침강선을 확인함으로써 독소여부 및 독소형의 감별이 가능하였다.


② RPLA test kit 이용법

포도구균 독소의 검출방법은 연구 또는 지속적인 검사의 목적이 아니라면 상품화된 RPLA(reversed passive latex aggutination) test kit(Oxoid사 제품) 의 이용이 신속 간편하며 보다 경제적이다.


2) 포도구균의 증식성 및 독소산생성


o 표준균(S.aureus ATCC13565, 14458, 19095 및 23235)을 BHI broth에 접종하여 37℃에서 16∼18시간 배양한 후, 이 배양액을 파장 600㎚에서 흡광도가 0.13이 되도록 BHI broth 로 희석하였다. 이 희석액을 다시 BHI broth로 10배 희석한 다음, 이 액 1.0㎖를 NZ-medium 50㎖가 들어있는 250㎖ 삼각플라스크에 접종 하였다. 이때 접종된 NZ-medium에서의 균수는 2.4∼8.5×104 cells/㎖였다.

접종된 NZ-medium은 10, 15 및 37℃에서 배양하면서 경시적으로 Baird parker agar(Difco)에서 생균수를 측정하였고. 이어서 배양액에 thimerosal을 0.01%되게 첨가하여 4℃에서 8000rpm으로 30분간 원심분리하였다.

원심상층액을 dialysis tube에 넣은 후, polyethylene glycol(PEG) 20000을 사용하여 5배 농축시켰다. 이 농축액을 microslide gel double diffusion test 또는 RPLA test kit를 이용하여 enterotoxin을 측정하였다.


o 배양온도별 포도구균의 증식성을 조사한 결과 10℃에서는 증식되지 않으나 15℃에서는 증식되었으며 증식속도는 균주에 따라 차이가 있었다. 이는 Brown 이 증식은 6.7℃에서 억제되는 것으로 보고한 것과는 상당한 차이가 있으며 Scheusnrer 등이 13℃에서 Strain 315(D형)는 증식되지 않았으며, Strain 265 (A형), 243(B형)은 증식되었음을 보고한 내용과는 유사했다. 따라서 포도구균의 증식성은 균주별로 상당한 차이가 있음을 알 수 있다. 배양조건별 포도구균의 독소산생능 시험결과 ATCC 13565 및 14458 은 15℃에서 72시간, ATCC 19095는 37℃에서 24시간, ATCC 23235 는 15℃에서 96시간 배양액에서 enterotoxin 이 검출되었으며 이때의 균수는 모두 106 cell/㎖ 이상 이었다.


이상의 시험결과는 종합해 볼때 포도구균독소의 검출은 microslide gel double diffusion test 또는 RPLA test kit를 이용 가능하며, 포도구균은 10℃ 이하에 서는 증식되지 않으나 15℃에서는 증식 뿐만아니라 enterotoxin이 산생되므로 식품의 가공 및 취급시 이 균의 오염방지에 최선의 노력을 기울여야 할 것이며 식품은 항상 10℃이하의 저온에 보관해야 할 것이다.


<참고문헌>

1. Barber, M, A. : 1914, Milk poisoning due to a type of Staphylococcus albus

occuring in the udder of a healthy cow, Phil. J. Sci., 9:515-519.

2. Bennett, R. W. and McClure, F. : 1976, Collaborative study of the serological

identification of staphylococcal enterotoxins by the microslide gel double

diffusion test, J. A. O. A. C., 59:594-601.

3. Brown, M.H. : Meat microbiology, Applied Science Publishers Ltd, London and

New York(1982) pp. 6, pp. 269-486.

4. Dack, G. M., Carry, W. E., Woolpert, O. and Wiggners, H. : 1930, Outbreak of

food poisoning proved to be to yellow hemolytic staphylococci, J. Prev. Med.,

4:167-175.

5. Minor, T. E. and Marth, E. H. : 1972, Staphylococcus aureus and staphylococcal

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6. Tatini, S. R. : 1973, Influence of food environments on growth of Staphylococcus

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7. Untermann, F. : 1972, Diagnosis of staphylococcal food poisoning, Fleishwirtshaft,

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8. 李 容旭, 金 宗圭 : 1987, 우리나라의 食中毒 發生動向 調査硏究, 食品衛生學會誌,

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